1980 এর দশকের শেষের দিকে, যদিও, লেজার কনফোকাল মাইক্রোস্কোপির একটি বড় ত্রুটি রয়েছে: কনফোকাল অ্যাপারচার শুধুমাত্র ফোকাল পয়েন্টের বাইরে উত্পন্ন ফ্লুরোসেন্সকে ব্লক করে না, তবে জৈবিক টিস্যু দ্বারা বিক্ষিপ্ত ফোকাল পয়েন্ট দ্বারা উত্পন্ন ফ্লুরোসেন্সকেও ব্লক করে, ফলস্বরূপ ফ্লুরোসেন্স সংগ্রহের দক্ষতা হ্রাস পায় এবং ইমেজিং গভীরতা 100 মাইক্রোমিটারের বেশি হতে পারে না। অতএব, 1990-এর দশকে, লেজার কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি এবং দুই-ফোটন উত্তেজনা প্রযুক্তির সমন্বয়ে দুই-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি অস্তিত্বে আসে। দুই-ফোটন শোষণ প্রক্রিয়ার উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য সাধারণত 680-1080 এনএম বায়ো-অপটিক্যাল উইন্ডো পরিসরে সেট করা হয়, যা কোষ বা জীবন্ত প্রাণীর অতিবেগুনি রশ্মির ক্ষতি এড়ায় এবং গভীরে প্রবেশ করে।
বর্তমানে, সর্বাধিক ব্যবহৃত দুই-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ হল ফেমটোসেকেন্ড টাইটানিয়াম রত্ন পাথরের লেজার, যা ভারী এবং ব্যয়বহুল, যা জীবন বিজ্ঞান, রসায়ন এবং ওষুধের মতো বিভিন্ন ক্ষেত্রে টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির প্রয়োগকে সীমিত করে। তাই কিছু ক্ষেত্রে যেমন মেডিকেল ডায়াগনস্টিকস, মানুষ প্রমিত আলোর উৎস হিসেবে কমপ্যাক্ট এবং সাশ্রয়ী সাব-ন্যানোসেকেন্ড সলিড-স্টেট লেজার ব্যবহার করার চেষ্টা করেছে।
দ্বি-ফোটন উত্তেজনার মূল নীতি হল, যখন একটি ফ্লুরোসেন্ট অণু উচ্চ ফোটন ঘনত্বের অধীনে উত্তেজিত হয়, তখন এটি একই সাথে দুটি দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন শোষণ করে এবং তারপরে উত্তেজনা লাফানো এবং শিথিলকরণ প্রক্রিয়ার পরে স্বতঃস্ফূর্তভাবে ফ্লুরোসেন্ট ফোটনগুলিকে স্থল অবস্থায় বিকিরণ করে। প্রচলিত একক-ফোটন উত্তেজনা ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির সাথে তুলনা করে, দুই-ফোটন উত্তেজনা ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপিতে অপটিক্যাল সিগন্যাল জেনারেশন অরৈখিক, উত্তেজনা আলো একটি দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্য, উচ্চ-পিক-শক্তির আলোর উৎস এবং নির্গত ফ্লুরোসেন্ট ফোটনের তরঙ্গদৈর্ঘ্য রয়েছে। উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্যের অর্ধেকের চেয়ে সামান্য বেশি।
টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি একটি কাছাকাছি-ইনফ্রারেড লেজার আলোর উত্স ব্যবহার করে এবং এর অরৈখিক প্রকৃতির জন্য কনফোকাল অ্যাপারচারের প্রয়োজন হয় না। অতএব, কনফোকাল মাইক্রোস্কোপির সাথে তুলনা করে, টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির নিম্নলিখিত সুবিধা রয়েছে:
- বড় ইমেজিং গভীরতা এবং কম অপটিক্যাল ক্ষতি;
- কোন কনফোকাল অ্যাপারচারের প্রয়োজন নেই, এবং ফ্লুরোসেন্স সংগ্রহের দক্ষতা ব্যাপকভাবে উন্নত হয়েছে;
- উচ্চতর স্থানিক রেজোলিউশন এবং বৈসাদৃশ্য;
- ছোট উত্তেজনা পরিসীমা, ছোট ফটোটক্সিসিটি এবং ব্লিচিং;
- নির্গমন এবং উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য অনেক দূরে, বর্ণালী ওভারল্যাপ এড়ানো;
